2019年1月CRISPR/Cas最新研究進展
發(fā)布時間:2019-02-11

20181126日,中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經(jīng)過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改,使得她們出生后就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內(nèi)外網(wǎng)站上迅速發(fā)酵,引發(fā)千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究,但是更多的是質(zhì)疑,甚至是譴責。


即將過去的1月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發(fā)現(xiàn)呢?小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞,供大家閱讀。


1.我國科學家成功克隆出5只基因編輯猴子作為生物節(jié)律紊亂動物模型

2019124日,在兩篇發(fā)表在National Science Review期刊上的論文中,中國研究人員克隆出5只基因編輯獼猴。這兩篇論文的標題分別為“BMAL1 knockout macaque monkeys display reduced sleep and psychiatric disorders”和“Cloning of a Gene-edited macaque monkey by somatic cell nuclear transfer”。

這些基因編輯獼猴通過體細胞核移植方法克隆出來。在大約一年前,這種方法被用來克隆出世界上第一只靈長類動物(也是獼猴)。但是,在這兩篇新的論文中,這些研究人員首先利用CRISPR-Cas9對這些猴子的基因組進行編輯,具體而言就是敲除在晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中起著重要作用的基因BMAL1,讓它們出現(xiàn)睡眠障礙的癥狀。

根據(jù)中國科學院神經(jīng)科學研究所非人靈長類動物研究平臺主任孫強(Sun Qiang)在一份新聞稿中的說法,這些研究人員隨后挑選出發(fā)生“正確的基因編輯和具有最嚴重的疾病表型”的猴子進行克隆。

這些研究人員在這些克隆獼猴中觀察到的疾病跡象包括失眠和血液激素的變化,以及焦慮、抑郁和“精神分裂癥樣(schizophrenia-like)”行為的增加。


2.Nature:重磅!首次成功地在哺乳動物中進行基因驅(qū)動

基因驅(qū)動(gene drive)是一種基因工程技術(shù),它促進后代要比正常情形時更頻繁地遺傳來自一個親本的特定等位基因。它已在昆蟲中發(fā)揮作用。如今,在一項新的研究中,來自美國加州大學圣地亞哥分校的研究人員發(fā)現(xiàn)它也能夠成功地在脊椎動物中發(fā)揮作用。在這項研究中,他們描述了一種方法,它利用CRISPR-Cas9改變雌性小鼠生殖系細胞,從而促進小鼠后代出現(xiàn)白色毛發(fā)和表達一種紅色熒光蛋白。相關(guān)研究結(jié)果于2019123日在線發(fā)表在Nature期刊上,論文標題為“Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPRCas9 in the female mouse germline”。

根據(jù)論文通訊作者、加州大學圣地亞哥分校進化發(fā)育生物學家Kimberly Cooper的說法,啟動這個研究項目的原因在于她和她的團隊想要能夠復制其他物種的遺傳變化,這樣他們就能夠理解這些變化如何導致特定性狀。但是,利用傳統(tǒng)的小鼠遺傳學,將多個轉(zhuǎn)基因組合在一起并且讓小鼠中每個轉(zhuǎn)基因的兩個等位基因保持純合是很棘手的。比如,在兩只小鼠中,讓每只小鼠攜帶相同的三個基因的突變拷貝需要將近150個后代才有90%的機會讓它們中的一個后代是純合的三重突變體。


3.基因編輯大牛張鋒新力作!發(fā)現(xiàn)第三種CRISPR-Cas系統(tǒng),顯著降低脫靶效應

來自原核生物CRISPR/Cas系統(tǒng)的酶已被用作可編程的和高度特異性的基因組編輯工具。目前的基因組編輯技術(shù)集中在IICRISPR-Cas系統(tǒng)上,該系統(tǒng)含有單個用于DNA切割的蛋白效應核酸酶。然而,到目前為止,僅有兩個II型核酸酶家族用于人細胞中的基因組編輯:Cas9,即一種由兩個向?qū)?/span>RNA(gRNA)引導的核酸酶,含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域:HNHRuvC,其中這兩個gRNACRISPR RNA(crRNA)tracrRNA;Cas12a,即一種由單個gRNA引導的核酸酶,含有單個結(jié)構(gòu)域:RuvC,其中這單個gRNAcrRNA

在一項新的研究中,來自美國布羅德研究所的張鋒(Feng Zhang)及其團隊著重關(guān)注第三種II型蛋白效應核酸酶:Cas12b,即一種由兩個gRNA引導的核酸酶,含有單個結(jié)構(gòu)域:RuvC,其中這兩個gRNAcrRNAtracrRNA。盡管Cas12b蛋白通常比Cas9Cas12a小,因而從通過病毒載體進行細胞內(nèi)遞送的觀點來看具有吸引力,但是得到最好描述的來自嗜酸耐熱菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)Cas12b核酸酶(AacCas12b)48°C時表現(xiàn)出最佳的DNA切割活性,這阻止它在哺乳動物細胞中的應用。張鋒團隊試圖鑒定出在較低溫度下有活性的Cas12b家族成員,這樣就可用于人類基因組編輯。相關(guān)研究結(jié)果于2019122日發(fā)表在Nature Communications期刊上,論文標題為“Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing”。

鑒于強效的基因組編輯工具應當在一系列靶標上是高效的和特異性的,張鋒團隊在針對293T細胞中的5個基因的56個靶位點上測試了BhCas12b v4突變體,結(jié)果觀察到強效的DNA切割。接著,他們通過電穿孔技術(shù)將BhCas12b v4-sgRNA復合物遞送到人CD4+ T細胞中。在3個測試的靶位點上,這些復合物表現(xiàn)出的indel發(fā)生率為32%49%。這些數(shù)據(jù)表明BhCas12b v4突變體在多種基因組編輯環(huán)境下(包括一種在治療上有重大意義的人細胞類型)可作為一種有效的可編程的核酸酶。

最終,張鋒團隊試圖確定BhCas12b在人細胞中的全基因組靶向特異性。他們選擇了9個在不同Cas核酸酶之間表現(xiàn)出相當?shù)?/span>indel活性的靶位點,并進行了Guide-Seq分析。針對BhCas12b v4突變體或AsCas12a,他們并沒有檢測到任何脫靶位點的存在,然而來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)在其中的6個靶位點上表現(xiàn)出顯著的脫靶切割。在14個非匹配性的位點上開展的進一步Guide-Seq實驗表明BhCas12b v4突變體僅在2個位點上檢測到脫靶切割。與這些發(fā)現(xiàn)相一致的是,當gRNA和靶DNA之間的位點120上發(fā)生雙位點錯配時,他們觀察到有限的indel活性,而且對單個位點錯配表現(xiàn)出較低的耐受性。這些結(jié)果對在人細胞中觀察到的較低的脫靶活性提供了一種分子水平上的解釋。


4.eLifeCrispr基因編輯技術(shù)有助于治療寄生蟲感染

喬治華盛頓大學(GW)的研究人員以及泰國,澳大利亞,英國和荷蘭等研究所的同事們首次成功地使用基因編輯工具CRISPR / Cas9來限制血吸蟲病和肝吸蟲感染的影響。他們的研究結(jié)果發(fā)表在今天發(fā)表在eLife期刊上的兩篇論文中。

“在我們的動物模型中,使用CRISPR / Cas9'敲除'的基因?qū)е赂腥景Y狀顯著減少,”作者說道 “我們的研究還表明,這種革命性的新生物醫(yī)學程序-CRISPR / Cas9-可用于研究蠕蟲寄生蟲,這是熱帶氣候中的主要公共衛(wèi)生問題。”

血吸蟲病可引起嚴重的健康問題,包括肝臟和腎臟受損,不育和膀胱癌。淡水蠕蟲曼氏血吸蟲通過鉆入皮膚進入人體;一旦進入血液,它們會移動到各種器官,在那里它們迅速開始繁殖。他們的卵釋放出幾種分子,包括一種叫做omega-1核糖核酸酶的蛋白質(zhì),可以破壞周圍的組織。 Brindley和他的研究團隊使用CRISPR / Cas9“敲除”了這種蛋白質(zhì),并發(fā)現(xiàn)它大大降低了這種疾病的影響。

肝吸蟲O. viverrini感染可引起一種稱為膽管癌的肝癌。這種寄生蟲通過攝入未經(jīng)烹煮或未煮熟的魚傳播。一旦進入體內(nèi),寄生蟲就會沉淀在人體肝臟中并分泌一種叫做顆粒蛋白的蛋白質(zhì),這種蛋白質(zhì)可能會促使肝細胞繁殖,從而增加患癌癥的風險。 Brindley和他的研究團隊使用CRISPR / Cas9去除編碼顆粒體的基因,并產(chǎn)生只能產(chǎn)生極少量蛋白質(zhì)的寄生蟲,導致肝吸蟲感染的癥狀明顯減輕。


5.Cell:利用CRISPR-Cas9鑒定出新的輔助性T細胞調(diào)節(jié)基因

T細胞是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵細胞。在一項新的研究中,來自英國威康基金會桑格研究所和芬蘭圖爾庫大學的研究人員構(gòu)建出首個逆轉(zhuǎn)錄病毒CRISPR-Cas9基因編輯文庫來探究對小鼠T細胞的調(diào)節(jié)。他們繪制出控制輔助性T細胞(T helper cell, Th)的最為重要的基因的圖譜,并鑒定出幾個新的調(diào)節(jié)基因?;诖耍麄兘沂玖撕芏嗖煌幕騾⑴cTh細胞激活和發(fā)育的復雜控制機制。理解是什么調(diào)節(jié)T細胞發(fā)育可能有助于發(fā)現(xiàn)新的藥物來抵抗免疫系統(tǒng)過度活躍導致的過敏和類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫疾病。此外,這些發(fā)現(xiàn)也可能有助于科學家們開發(fā)新的療法來激活免疫系統(tǒng),從而抵抗感染或攻擊腫瘤細胞。相關(guān)研究結(jié)果于2019110日在線發(fā)表在Cell期刊上,論文標題為“Genome-wide CRISPR Screens in T Helper Cells Reveal Pervasive Crosstalk between Activation and Differentiation”。

免疫系統(tǒng)保護身體免受感染和腫瘤的侵害。2型輔助性T細胞(T helper type 2, Th2)是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵組成部分,它們釋放特定的化學物質(zhì)來告訴身體殺死入侵者。當檢測到入侵者時,Th2細胞被激活。它們隨后需要沿著正確的途徑進行發(fā)育以便最好地協(xié)助清除特定的感染,這一過程稱為分化。然而,仍然不清楚的是究竟是什么信號激活這些細胞或告訴它們?nèi)绾伟l(fā)育以及釋放哪些化學信號。

為了研究這一點,這些研究人員構(gòu)建出一個新的由8.8萬個向?qū)?/span>RNA(gRNA)組成的全基因組CRISPR文庫。這些gRNA讓他們能夠關(guān)閉來自小鼠Th2細胞的2萬個基因中的每一個。在模擬體外培養(yǎng)的Th2細胞受到感染后,他們研究了關(guān)閉基因組中的每個基因如何影響它們的激活或分化。他們發(fā)現(xiàn)了許多參與調(diào)節(jié)Th2細胞發(fā)育的不同基因,并確定了一個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。


6.Cell:給Cas9一個開啟開關(guān),從而更好地控制CRISPR基因編輯

在一項新的研究中,來自美國加州大學伯克利分校的研究人員利用一種稱為循環(huán)排列(circular permutation)的技術(shù),構(gòu)建出一套稱為Cas9-CP的新型Cas9變體,這將簡化Cas9融合蛋白的設(shè)計,使得它們能夠用于除了簡單的DNA切割之外的多種應用,比如堿基編輯和表觀遺傳修飾。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2019110日的Cell期刊上,論文標題為“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification”。

通過這個相同的過程,這些研究人員將“永遠開啟(always-on)”的Cas9分子轉(zhuǎn)變?yōu)榭杉せ畹拈_關(guān)。這些開關(guān)保持在“關(guān)閉”位置,直到它們被蛋白酶激活。由此產(chǎn)生的蛋白酶感應的Cas9(protease-sensing Cas9, ProCas9)能夠減少脫靶效應并實現(xiàn)分子感應,以及組織或器官特異性的基因組編輯。他們證實ProCas9可用于檢測病毒蛋白酶,從而潛在地用作一種能夠引發(fā)免疫反應的病原體感應系統(tǒng)。

Savage和他的團隊使用循環(huán)排列來重新設(shè)計Cas9的分子序列,因而更好地控制它的活性并為融合蛋白構(gòu)建更優(yōu)化的DNA結(jié)合支架。這種Cas9重新連接方法涉及將這種蛋白的末端(即它的氨基端和羧基端)與肽接頭(peptide linker)連接,同時在不同的位置上分割它的序列,從而產(chǎn)生新的相鄰的氨基端和羧基端。

這些研究人員發(fā)現(xiàn)Cas9對循環(huán)排列具有很強的延展性。這種蛋白的多個區(qū)域具有熱點,這些熱點可在多個位置上打開,從而產(chǎn)生多樣性的Cas9-CP,所產(chǎn)生的Cas9-CP可用作高級融合蛋白的支架。目前,Cas9的氨基端和羧基端是固定的,并且它們并不適合放置用于結(jié)合DNA的融合蛋白。相比之下,這些新的蛋白支架的末端更靠近這種蛋白的DNA相互作用界面,并且經(jīng)優(yōu)化后可高效地構(gòu)建融合蛋白。

這些研究人員接下來通過設(shè)計肽接頭來產(chǎn)生ProCas9,并且這種肽接頭足夠短以便將這種蛋白限制在沒有活性的狀態(tài),隨后引入可利用匹配的病毒蛋白酶加以切割的序列。此后,這些ProCas9經(jīng)調(diào)整后可作為利他的能夠檢測病原體并對它們作出反應的防御系統(tǒng)。當通過切割這種肽接頭激活這些ProCas9時,它們產(chǎn)生大量的DNA損傷并殺死受感染的細胞。


7.Nat Microbiol:基因編輯技術(shù)可以設(shè)計新型抗生素

在最近一項研究中,威斯康星大學麥迪遜分校和加利福尼亞大學舊金山分校的的研究人員利用基因編輯工具CRISPR來研究特定抗生素靶向的基因,尋找如何改善現(xiàn)有抗生素或開發(fā)新抗生素的線索。

研究人員將Mobile-CRISPRi從常見的實驗室菌株轉(zhuǎn)移到不同的細菌中,甚至包括一些研究不多的微生物。這種易于轉(zhuǎn)移的特性使得該技術(shù)成為科學家研究任何導致疾病的有效手段。

PetersCarol Gross,Oren Rosenberg以及加州大學舊金山分校和其他機構(gòu)的其他同事一起設(shè)計和測試了Mobile-CRISPRi。該系統(tǒng)減少了靶基因介導的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,使研究人員能夠確定抗生素如何抑制病原體的生長。相關(guān)成果于17日在《Nature Microbiology》雜志上發(fā)表。作者們使用被稱為CRISPRi的一種缺陷型CRISPR,它只是能夠結(jié)合在DNA上,但無法切割DNA。這進一步阻止其他蛋白質(zhì)進入并啟動特定基因的表達。


8.JCI insightCRISPR-CAS9 基因編輯技術(shù)用于治療肌營養(yǎng)不良癥

CRISPR的基因編輯技術(shù)是治療遺傳性疾病的革命性方法。但是,該工具尚未用于有效治療長期慢性病。由密蘇里大學醫(yī)學院的Dongsheng Duan博士領(lǐng)導的一個研究小組已經(jīng)確定并克服了CRISPR基因編輯的障礙,這可能為使用該技術(shù)進行持續(xù)治療奠定基礎(chǔ)。

CRISPR基因編輯的靈感來自于身體抵御病毒的天然防御能力。該技術(shù)使研究人員能夠通過切除和替換基因組中的突變來改變DNA序列,該突變有可能治療各種遺傳疾病和病癥。 Duan和他在美國國立衛(wèi)生研究院和杜克大學推進轉(zhuǎn)化科學國家中心MU的合作者正在研究如何利用CRISPR治療Duchenne肌營養(yǎng)不良癥(DMD)

Duan的實驗室使用CRISPR靜脈內(nèi)治療6周齡DMD小鼠。他們最初采用了許多研究人員廣泛使用的策略。在該方法中,施用相似量的Cas9gRNA。雖然直接注入肌肉時效果很好,但當團隊試圖在身體的所有肌肉中實現(xiàn)長期矯正時,這種策略產(chǎn)生了不良后果。他們發(fā)現(xiàn),骨骼肌中沒有肌營養(yǎng)不良蛋白的恢復,心臟中的肌營養(yǎng)不良蛋白恢復很低 - 治療無法阻止疾病進展。


9.Mol Cell:科學家破解出新型CRISPR代碼 有望更加精準地進行人類基因組編輯

近日,一項刊登在國際雜志Molecular Cell上的研究報告中,來自Francis Crick研究所的科學家們通過研究發(fā)現(xiàn)了一組簡單的規(guī)則或能決定人類細胞中CRISPR/Cas9基因編輯的精準性,相關(guān)研究結(jié)果或能幫助科學家們改善實驗室和臨床中基因編輯技術(shù)的效率和安全性。盡管如今科學界已經(jīng)廣泛使用CRISPR系統(tǒng)了,但該技術(shù)的合理應用常常因為基因編輯結(jié)果的不可預測而受到重重障礙,基因編輯常常會帶來靶向位點DNA區(qū)域的隨機剔除或插入。

通過檢測并分析CRISPR基因編輯技術(shù)對人類細胞450個基因的1491個靶向作用位點的作用效應,研究人員發(fā)現(xiàn),基于簡單的規(guī)則就能夠有效預測基因編輯所帶來的后果,這些規(guī)則主要依賴于導向RNACas9所識別的特定基因組區(qū)域中的遺傳元件。這項研究中,研究者發(fā)現(xiàn),特定基因編輯的結(jié)果常常取決于RNA導向的第四個“字母元件”,其更靠近切割位點。如果遺傳元件是AT,那么這將會是一個非常精準的基因插入,如果是C的話就會導致相對精準的剔除,而G的話則會造成多種不精準的剔除作用。因此,在基因編輯過程中,簡單地避免含有堿基G的位點或許能夠更加準確地預測基因編輯所產(chǎn)生的效果。

研究者Anob Chakrabarti指出,我們通過分析發(fā)現(xiàn),決定CRISPR人類基因組編輯結(jié)果的規(guī)則實際上非常簡單,在設(shè)計導向RNA時要記住這些規(guī)則,這樣我們就能最大化的獲得特定基因編輯的理想效果,這在臨床中尤為重要。同時研究者還闡明了開啟或關(guān)閉靶向DNA如何影響基因編輯的效果,而加入促進DNA打開的化合物就能夠促進Cas9搜尋基因組,從而提高編輯效率。研究者表示,不管來源的組織如何(其會影響特定基因DNA開啟的程度),靶向作用關(guān)鍵位置中含有堿基AT的區(qū)域能夠表現(xiàn)出常見的編輯效果,也就是說,如果我們能夠仔細選擇靶向DNA的話,我們就能夠在不同組織中觀察到相同的效應。

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